Еще М. В. Ломоносовым в 1764 г. был обнаружено, что растворы замерзают при более низкой температуре, чем чис­тые растворители. Понижение температуры замерзания раст­вора связано с понижением упругости (давления) пара раст­ворителя над раствором (изменение концентрации клеточного сока у растений к зиме).

Температурой замерзания раствора называется такая темпера­тура, при которой кристал­лы растворителя находятся в равновесии с раствором данного состава.

Разность Δt = t 0 ° — ti° называется понижением температуры замерзания раствора и будет тем больше, чем больше концентрация раствора. Количественно эта зависи­мость выражается уравнением:

Δt = K С m (36)

где Δt — понижение температуры замерзания раствора;

Сm — моляльная концентрация;

К — коэффициент пропорциональности, называемый криоскопической постоянной растворителя или моляльным понижением температуры замерзания раствора.

Метод исследования, основанный на измерении понижения температуры замерзания растворов, называется криоскопическим методом.

Растворы замерзают при более низкой и кипят при более высокой температуре, чем чистые растворители.

Для растворов неэлектролитов согласно закону Рауля понижение температуры замерзания раствора прямо пропорционально моляльной концентрации (уравн.36).

Повышение температуры кипения раствора так же прямо пропорционально моляльной концентрации:

Δt кип =ЕC m (37)

Е- эбулиоскопическая постоянная.

Осмотическое давление растворов рассчитывается по формуле Вант-Гоффа:

Р осм =RTC м (38)

R- универсальная газовая постоянная 8,314 кДж/моль град

T- температура, 0 К, C м -молярная концентрация.

Контрольные вопросы

1.В чем суть закона распределения?

2.Вывод закона распределения.

3.Применение закона распределения.

4.На каком условии фазового равновесия основан вывод закона распределения?

5.Какие факторы влияют на значение коэффициента распределения?

6.Какая экстракция эффективнее: однократная или дробная?

Задачи

Номер задания	m г H 2 O	m г САХАРОЗЫ	Номер задания	m г H 2 O	m г САХАРОЗЫ
		60	.2
		55

ПРИ КАКОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ БУДУТ КИПЕТЬ РАСТВОРЫ, СОДЕРЖАЩИЕ В m г ВОДЫ m г САХАРА. ПОСТРОИТЬ ГРАФИК ЗАВИСИМОСТИ температуры кипения от содержания растворенного вещества в растворе

Номер задания	m г H 2 O	m г САХАРОЗЫ	Номер задания	m г H 2 O	m г САХАРОЗЫ
		60
		55

Номер задания	m г H 2 O	m г ГЛЮКОЗЫ	Номер задания	m г H 2 O	m г ГЛЮКОЗЫ
		4,57			10,01
					12,57
					5,56
					14,40
		8,32			11,54

ОПРЕДЕЛИТЬ ТЕМПЕРАТУРУ ЗАМЕРЗАНИЯ РАСТВОРА В m г H 2 O КОТОРОГО, СОДЕРЖИТСЯ m г ГЛЮКОЗЫ ПОСТРОИТЬ ГРАФИК ЗАВИСИМОСТИ температуры ЗАМЕРЗАНИЯ от содержания растворенного вещества в растворе

Изменения, наступающие в биологических объектах под влиянием низких температур,
можно разделить на: 1) изменения физиологического характера; 2) изменения физико-
химического порядка; 3) изменения механического порядка. К явлениям физиологического
характера следует отнести так называемый температурный шок, возникающий в результате
воздействия низких температур. Термин «температурный шок» впервые был предложен
Миловановым в 1934 г., наблюдавшим потерю подвижности сперматозоидов быка и
барана в результате их внезапного охлаждения от 15 до 0°.

Температурный шок при внезапном охлаждении. наблюдается и у ряда видов
бактериальных клеток, особенно в фазе логарифмического роста. При быстром
охлаждении молодых культур от 37 до 0° погибает до 95% особей бактерий Е. соП. При
постепенном снижении температуры в указанных пределах бактериальные клетки не
повреждаются. Температурного шока можно избежать путем постепенного охлаждения
организмов и изолированных клеток в тех же пределах температуры, в которых при
быстром и сверхбыстром, охлаждении возникает шок. Постепенное охлаждение
способствует так называемой холодной адаптации, частичного уменьшения содержания
воды.

На чувствительность клеток к температурному шоку существенно влияет состав среды,
в которой они находятся. Чувствительность сперматозоидов к температурному шоку
значительно понижается при добавлении к сперме в качестве разбавителя яичного желтка,
защитное действие которого обусловливается предположительно за счет лецитина.

Эритроциты при быстром охлаждении от 30 до 5° обычно не повреждаются, но
повышение концентрации, хлористого натрия до 0,8М и выше ведет в этих условиях к
гемолизу их.

Температурный шок может возникать у одноклеточных многоклеточных организмов
при быстром охлаждении их не только до 0°, но и ниже. Было доказано, что лейкемические
клетки мышей выживают, сохраняя способность к заражению, только при условии
медленного замораживания до -70°. Более высокая выживаемость наблюдается и при
медленном охлаждении от 0 до -79° патогенных простейших и сперматозоидов по
сравнению с быстрым и сверхбыстрым замораживанием.

Патогенные амебы и другие простейшие, ткани яичника, яйцеклетки млекопитающих,
ткани гипофиза и надпочечника, ткань семенника, опухолевые клетки и некоторые виды
микроорганизмов сохраняют жизнеспособность, при медленном замораживании, но не
переносят быстрого и сверхбыстрого охлаждения до низких температур. Механизм
температурного шока в результате быстрого и сверхбыстрого охлаждения до нуля и
замораживания при низких температурах объясняется внезапным изменением
осмотического давления внутри клеток. Медленное охлаждение ослабляет интенсивность
изменения осмотического давления вследствие диффузии воды из клеток через клеточные
мембраны и кристаллизации ее в межклеточных пространствах. Это явление называют
также температурной адаптацией. Быстрого и сверхбыстрого замораживания и хранения
биологических материалов при возможно низкой температуре. К таким материалам
относятся ферменты и некоторые виды микроорганизмов.

Одним из преимуществ быстрого охлаждения является также то, что в этих условиях
действие концентрированных левых растворов после выделения льда занимает менее
продолжительный период до достижения их эвтектической точки.

Что касается тканей млекопитающих, предназначенных для последующей трансплантации или культивирования, за исключением клеток некоторых опухолей,
паращитовидной желез, то они в большинстве случаев после быстрого и замораживания не проявляют признаков жизнеспособности. Следовательно, оптимальная скорость охлаждения и замораживания зависит от ряда условий.

Нарушения физиологического характера, наступающие при замораживании, обычно
сопровождаются физико-химическими и структурными изменениями в биологических
системах. Эти изменения обусловливаются в основном вне- и внутриклеточной
кристаллизацией воды и эвтектической концентрацией солей. Оба указанных фактора тесно
взаимосвязаны и взаимозависимы. Один из них вызывает чисто механические
(кристаллизация), другой (концентрация солей) - физико-химические изменения в
клетках животного и растительного происхождения. Увеличению концентрации
электролитов при замораживании всегда сопутствует кристаллизация воды. Увеличение
концентрации солей, как при положительных температурах, так и при замораживании
ведет к денатурации белков и к растворению липопротеинов.

При замораживании любого биологического материала, безусловно содержащего в
растворенном состоянии различные соли, наблюдается эвтектическое разделение раствора.
Сначала кристаллизируется чистая вода, а соли концентрируются в незамерзшей части до
тех пор, пока не будет достигнута наивысшая их концентрация. Предел максимальной
концентрации солей материалов любого происхождения, вслед за которым наступает
полное затвердение раствора при низких температурах, называют эвтектической точкой.
Так, например, максимальная (эвтектическая) концентрация поваренной соли,
составляющая 22,42%, достигается при температуре -21,2°. При понижении температуры
концентрация соли больше не увеличивается, так как такой раствор полностью
затвердевает.

Степень повреждающего действия концентрированных солей, приближающаяся к
эвтектической, зависит от состава суспензии, количества белка, а также от природы соли и
скорости замораживания.

Жидкости биологических систем являются обычно весьма сложными растворами,
содержащими целый комплекс солей с разными эвтектическими точками. В таких
растворах, по данным Рэ, практически невозможно определить эвтектическую точку в
силу разности эвтектической концентрации различных солей. В сложных биологических
растворах обычно определяется эвтектическая зона в пределах 10° и более с минимальной и
максимальной границами. В интервале этой зоны и происходит замерзание
гипертонических растворов разных солей.

Гипертоническая концентрация солей губительно влияют на ткани и клетки животных,
простейших и бактерий в процессе замораживания и хранения при температурах равных
эвтектической зоны.

В процессе замораживания вода из клеток переходит в окружающую среду с такой
скоростью, что точка замерзания их внутреннего содержимого становится несколько ниже
точки замерзания окружающей жидкости. К моменту, когда окружающая клетки жидкость
концентрируется до насыщения, содержимое клеток оказывается достаточно обезвоженным
и не может замерзнуть. Вне- и внутриклеточная кристаллизация всегда сопровождаются
концентрированием солевых растворов при низких температурах, разрушающее действие
которых в настоящее время доказано и не вызывает сомнения. Однако нельзя не учитывать
и действие кристаллов льда, вызывающее разрушение коллоидных растворов, нарушение
равновесия между гелем и золем и связи ферментов с их субстратами.

Особенно вредна внутриклеточная кристаллизация воды, как правило, ведущая к
разрушению структуры и гибели животных клеток. При быстрых скоростях охлаждения
вне- и внутриклеточная кристаллизация может наступать практически одновременно.
При сверхбыстрых скоростях охлаждения до очень низких температур стадия
кристаллизации минуется и препарат переводится в стекловидное состояние
(витрифицируется). По утверждению Люйе, гибель клетки не наступает, если удается
перевести протоплазму в стекловидное состояние и затем вновь в жидкое, минуя стадию
кристаллизации. Он показал, что критическая зона температуры, при которой образуются
кристаллы, находится в пределах 0 до -40°. При сверхбыстром охлаждении
концентрированных растворов белков, Сахаров и многоатомных спиртов, нанесенных в виде
тонкой пленки путем погружения в сжиженные атмосферные газы при температурах от -150
до -196°, они превращаются в прозрачные «стекла». При медленном отогревании такие
«стекла» кристаллизуются и становятся непрозрачными, а при быстром отогревании они
тают, не подвергаясь кристаллизации.

Замерзание представляет собой фазовый переход, при котором происходит превращение жидкости в твердое вещество. Температурой замерзания 9кристаллизации) жидкости называют ту температуру, при которой давление насыщенного пара над жидкостью равно давлению насыщенного пара над выпадающими из нее кристаллами твердой фазы.

При этой температуре и соответствующем ей давлении насыщенного пара скорость кристаллизации равна скорости плавления и обе эти фазы могут сосуществовать в течение длительного времени.

Еще М.В. Ломоносов заметил, что разбавленный раствор замерзает при температуре более низкой, чем чистый растворитель. Так, морская вода замерзает не при 273 К, а при несколько более низкой температуре. Многочисленные эксперименты показали, что такое изменение температуры замерзания раствора можно рассматривать как общее правило.

Процессы замерзания и кипения были детально изучены Раулем и представлены в виде закона, который в последствии был назван вторым законом Рауля.

рассмотрим простейший вывод этого закона. На рис.2 показана диаграмма, выражающая зависимость давления насыщенног пара от температуры над чистым растворителем и над раствором.

Кривая 0А – зависимость давления насыщенного пара чистой воды от температуры.

Кривая ВС, ДЕ – зависимость давления насыщенного пара воды над растворами с различными концентрациями растворенного вещества

0Д – выражает температурную зависимость давления насыщенного пара воды над льдом.

Из рис.2 видно, что давление пара над раствором при 273 К ниже, чем над водой, но оно не равно давлению пара над льдом при той же температуре. Лишь при температуре ниже 273 К (Т’з) давление пара над раствором уменьшается настолько, что становится равным давлению пара над льдом. Этому соответствует точка В. При более высоких концентрациях раствора кривые, выражающие зависимость давления пара воды над раствором от температуры, располагаются ниже кривой ВС, но параллельно ей.

Введем следующий обозначения:

Р 0 А – давление пара над чистым растворителем при 273 К

Р А – давление пара над раствором при температуре его замерзания Т’ з

Из прямоугольного треугольника ВОК определяем

Из рисунка 2 видно, что , где - понижение температуры замерзания раствора.

Подставляя эти значения в выше записанное уравнение, получим

(3)

Из первого закона Рауля для сильно разбавленных растворов имеем

и (4)

где n А, n В, m А сохраняют ранее присвоенные обозначения (см. выше). Если через М 0 А обозначить молярную массу растворителя, то

При подстановке этого выражения в уравнение (4) получим

Умножим и разделим правую часть этого выражения на 1000, тогда

(5)

Объединим все постоянные величины в уравнении (5) в одну постоянную К (), получим следующее выражение

(6)

Выражение представляет собой моляльность раствора Св.

Подставив это выражение в уравнение (6), получим окончательное уравнение.

(7)

Это и есть математическое выражение второго закона Рауля: понижение температуры замерзания или повышение температуры кипения растворов прямо пропорционально его моляльной концентрации.

Коэффициент К в уравнении (7) носит название криоскопической постоянной, показывает молярное понижение температуры замерзания раствора, является индивидуальной характеристикой растворителя (К Н2О =1,86º) и имеет ту же размерность, что и Е (Кº·кг·моль -1)

Метод исследования, основанный на измерении понижения температуры замерзания растворов, называется криоскопическим. Он также, как и эбуллиоскопический позволяет вычислить молярную массу растворенного вещества

На рис.3 изображен прибор, предназначенный для измерения температуры замерзания растворов.

ОСМОС И ОСМОТИЧЕСКОЕ ДАВЛЕНИЕ .

Весьма важным в биологическом отношении свойством растворов является осмос.

В природе часто растворы отделяются от растворителя мембранами, проницаемыми лишь дл я частиц растворителя. В этом случае растворенное вещество диффундировать в растворитель не может, и будет наблюдаться только переход растворителя в в раствор, т.е. растворитель будет перемещаться в обоих направлениях, но все же в раствор его будет переходить немного больше, чем в обратном направлении.

Механизм осмоса легко представить на основе изотермической перегонки. Пусть полупроницаемая мембрана, имеющая микропоры, разделяет растворитель и раствор с концентрацией С в (рис.4)

В пору, ограниченную с одной стороны растворителем, а с другой раствором, идет испарение. Вследствие повышения по закону Рауля упругости насыщенного пара со стороны растворителя из парообразной фазы концентрируется, переходя в раствор.

В результате осмоса увеличивается объем раствора, и его концентрация постепенно снижается; проникающий через мембрану в раствор растворитель увеличивает столб жидкости h и, следовательно, повышает гидростатическое давление (см. рис.5). Одновременно будет возрастать число молекул растворителя, перемещающихся через мембрану в обратном направлении, т.е. из раствора в растворитель. постепенно гидростатическое давление и разбавление раствора достигнут величин, при которых количество молекул растворителя, перемещающихся в обоих направлениях, уравняется и наступит осмотическое равновесие. Развившееся в результате осмоса избыточное гидростатичекое давление, измеряемое столбом раствора высотой h, при котором устанавливается осмотическое равновесие, называют осмотическим давлением.

рис. 5

Полупроницаемыми для многих растворов являются мембраны из коллодия, целлофана, железистосинеродистой меди и др.

ЗАКОНЫ ОСМОТИЧЕСКОГО ДАВЛЕНИЯ .

Изучение законов осмотического давления выявило их полную аналогию с газовыми законами. Для разбавленных растворов неэлектролитов их можно сформулировать так:

при постоянной температуре осмотическое давление прямо пропорционально молярной концентрации растворенного вещества (аналогия с законом Бойля-Мариотта):

при постоянной молярной концентрации осмотическое давление прямо пропорционально абсолютной температуре (аналогия с законом Гей-Люссака):

Из двух этих законов следует, что при одинаковых молярных концентрациях и температуре растворы разных неэлектролитов создают одинаковое осмотическое давление, т.е. эквимолярные растворы неэлектролитов изотоничны (аналогия с законом Авогадро).

Вант-Гоффом был предложен объединенный закон для осмотического давления в растворах (аналогично объединенного газовому закону Менделеева-Клайперона): Осмотическое давление разбавленных растворов неэлектролитов прямо пропорционально молярной концентрации, коэффициенту пропорциональности и абсолютной температуре:

так как с=n/V, где n – число молей неэлектролита, а V – объем раствора, то или

Если некоторым людям уроки географии могут сниться только в страшном сне, у меня всё не так. Я с радостью читаю научную литературу, хорошо разбираюсь в географических картах, и с легкостью могут помочь любому школьнику. Однажды я поняла, что знания необходимо постоянно развивать . Сейчас объясню, как я пришла к этому выводу.

Я приехала к морю в октябре, чтобы пройти оздоровительные процедуры. В тот день было очень холодно, но я вышла на улицу, чтобы прогуляться возле берега. Но, посмотрев на смарт часы, удивилась: температура 0°C. Тогда почему вода в море не замерзла? Сегодня вместе найдем ответы.

При какой температуре замерзает вода

Наука хороша тем, что можно найти любой ответ. Ты только задумался, а ответ уже готов. Просто необходимо быть более любопытным, читать больше книг. Ученые уже давно огласили теорию, что вода замерзает при температуре 0°C . Подобная информация есть в учебниках для школьников. Но это неправда. Потому что вода застывает, а не замерзает. Процесс превращения воды в лёд называется кристаллизацией (это более точный термин).

Когда температура достигает 0°C вода начинает менять форму. Соответственно не замерзает полностью, а только начинает застывать. Стоит учитывать состав жидкости, если в воде есть примесь (соль, песок, пыль), она будет застывать дольше. Нет оснований для построения кристаллической структуры, процесс замерзания замедляется.

Хватит верить в мифы о воде

Проще запомнить несколько утверждений, чем читать энциклопедии, проводить эксперименты. Поэтому, даже в 21 веке люди руководствуются ложными суждениями.

Топ известных мифов о воде:

• Дистиллированная вода - самая лучшая для питья. На самом деле, в процессе чистки уничтожаются всё, полезные минералы в том числе.

• Вода - бесцветная субстанция. Вода не только обладает прозрачностью (может быть мутной), но имеет оттенок, подземные воды имеет желтоватый или сероватый оттенок. Морская вода может быть голубой, темно-синей.

• Воду можно пить в неограниченных количествах. Существует формула, которая определяет дневную норму жидкости , которую должен выпить человек. Всё зависит от веса (минимум два литра в день).

Вода - источник жизни . Она обладает силой, необходимо аккуратно пользоваться этим подарком природы.

Криосохранение крупных биологических объектов

Наиболее интригующая область приложения криобиологии – науки о влиянии низких и сверхнизких температур на биологические объекты – поиск возможностей сохранения живых организмов или отдельных органов в состоянии глубокой заморозки. Методика криосохранения отдельных клеток или, например, эмбрионов разработана неплохо, но обратимое (т.е. с сохранением жизнеспособности после размораживания) замораживание крупных объектов наталкивается на серьезные препятствия. Основная трудность состоит в том, что при больших объеме и массе трудно добиться равномерного охлаждения. Неравномерное же замерзание приводит к серьезным и необратимым повреждениям клеток и тканей. Между тем решение этой проблемы могло бы помочь, например, созданию банка органов для трансплантации и тем самым спасти жизнь тысячам больных. Еще более заманчивой выглядит возможность сохранения в состоянии глубокого охлаждения тяжелобольного – до тех пор, пока медицина не окажется в состоянии ему помочь, может быть, через десятилетия.

Наибольшую опасность при замораживании представляет механическое повреждение мембран клеток образующимися кристаллами льда. Образуясь как вне, так и – что гораздо опаснее – внутри клеток, они разрывают липидный бимолекулярный слой, формирующий эти мембраны.

Для защиты клеток от повреждения при замораживании используют специальные вещества – криопротекторы. Они делятся на две группы: проникающие внутрь клетки, или эндоцеллюлярные (диметилсульфоксид (ДМСО), ацетамид, пропиленгликоль, глицерин, этиленгликоль), и не проникающие или экзоцеллюлярные (полиэтиленгликоли и полиэтиленоксиды, фиколл, сахароза, трегалоза и др.), которые действуют снаружи, осмотически вытягивая из клетки воду.

Последнее выгодно: чем меньше в клетке останется воды, тем меньше потом образуется льда. Но удаление воды приводит к повышению концентрации остающихся внутри клетки солей – вплоть до значений, при которых происходит денатурация белка. Эндоцеллюлярные же криопротекторы не только снижают температуру замерзания, но и разбавляют образующийся при кристаллизации «рассол», не давая белкам денатурироваться.

Наиболее широкое применение нашли глицерин и ДМСО. При добавлении их к воде температура ее замерзания понижается, достигая низшего значения при соотношении примерно 2:1. Эта наиболее низкая температура называется эвтектической , или криогидратной . При дальнейшем же охлаждении таких смесей размеры образующихся кристаллов льда оказываются столь мелкими (сравнимыми с размером кристаллической ячейки), что они не наносят значительных повреждений структурам клеток.

Если бы можно было довести концентрацию криопротектора в живых тканях до эвтектической, это позволило бы полностью решить проблему повреждения тканей ледяными кристаллами. Однако при таких концентрациях любые известные криопротекторы оказываются токсичными.

На практике используют концентрации криопротекторов значительно меньшие, чем эвтектические, – и при этом часть воды все же замерзает. Так при использовании 27%-ного раствора глицерина 40% присутствующей в клетке воды образует с глицерином эвтектическую смесь, остальная же ее часть замерзает. Однако, как показали эксперименты, проведенные в 1954–1960 гг. английским криобиологом Одри Смит, золотистые хомячки способны выживать в ситуации, когда в лед превращалось до 50–60% воды, содержащейся в тканях их головного мозга!

Большое значение для решения проблемы обратимого замораживания имеет скорость охлаждения. При медленном охлаждении (в парах жидкого азота или в специальных программных замораживателях) кристаллы льда образуются в основном в межклеточном пространстве. По мере охлаждения они растут, оттягивая на себя воду из клеток. Как уже было сказано, это позволяет существенно уменьшить повреждения, наносимые кристаллами клеткам, – но и концентрация солей внутри клеток значительно возрастает, повышая риск денатурации белков.

К сожалению, оптимальные скорости понижения температуры, при которых достигается компромисс между повреждающими действиями кристаллов льда и высокими концентрациями растворенных веществ, для разных типов клеток сильно различаются. Различны также и оптимальные для них концентрации криопротекторов. Это сильно затрудняет криосохранение органов и тканей, включающих несколько различных типов клеток, а тем более – целых организмов.

При быстром охлаждении (например, опускании образца в жидкий азот) вода не успевает продиффундировать из клеток наружу; кристаллы образуются как вне, так и внутри клеток, но за счет более быстрого охлаждения они оказываются значительно мельче, чем в первом случае, и успевают образоваться не во всех клетках. Токсичных концентраций солей при этом удается избежать, а продолжительность их воздействия оказывается меньше, как и продолжительность вредного воздействия криопротекторов. Последнее позволяет использовать более высокие их концентрации.

При достаточно быстром охлаждении до 0 °С и несколько ниже вода замерзает (кристаллизуется) не сразу. Сначала образуется переохлажденная жидкость. В упомянутых экспериментах Смит ей в отдельных случаях удавалось охладить золотистых хомячков до –6 °С без образования кристаллов льда. При этом кожа и конечности животных оставались мягкими. А после согревания хомячки оживали без видимых вредных последствий. Беременные самки (если переохлаждение имело место в первой половине срока беременности) приносили нормальных детенышей.

Существует методика проведения хирургических операций на новорожденных детенышах мелких млекопитающих – например, мышатах. Наркоз в таком возрасте практически неприменим, и поэтому детенышей в течение 15–20 минут просто охлаждают до потери подвижности и чувствительности. Известен случай, когда при проведении таких исследований (влияние удаления вомероназального органа на поведение грызунов) в лаборатории одного из московских институтов нескольких новорожденных детенышей джунгарского хомячка по небрежности экспериментатора просто забыли лежащими на ватной подстилке в камере с температурой –12 °С. После извлечения – через 2–3 часа – они были совершенно твердыми, и их тела в буквальном смысле «издавали деревянный стук». Через некоторое время при комнатной температуре детеныши ожили, начали двигаться и издавать звуки...

Жидкости в организме начинают замерзать обычно при –1... –3 °С. Однако по мере того, как часть воды превращается в лед, концентрация растворенных веществ в оставшейся жидкости возрастает и температура замерзания этой жидкости продолжает снижаться.

Температура полного замерзания различных биологических жидкостей сильно варьирует, но в любом случае оказывается ниже –22...–24 °С.

Вероятность образования «зародыша» кристалла льда за единицу времени в переохлажденной жидкости пропорциональна объему этой жидкости и сильно зависит от температуры: при –40 °С и при давлении в 1 атм. кристаллизация чистой воды происходит практически мгновенно, но при еще более низких температурах (порядка –70 °С скорость роста кристаллов замедляется за счет увеличения вязкости воды. Наконец, при температуре примерно –130 °С рост кристаллов полностью приостанавливается. Если охлаждать жидкость достаточно быстро, чтобы «проскочить» температуру активной кристаллизации прежде, чем успеют сформироваться кристаллы опасного размера, вязкость возрастает настолько, что образуется твердое стеклообразное вещество. Это явление называется стеклованием или витрификацией .

Если удастся охладить клетки или ткани до температуры стеклования, они смогут сохраняться в таком состоянии неограниченно долго, а полученные при этом повреждения окажутся несравненно меньше, чем при охлаждении с кристаллизацией. Собственно, это и явилось бы решением проблемы сохранения биологических объектов в состоянии глубокой заморозки. Правда, при оттаивании клеток для их оживления придется снова проходить опасный участок температур...

Скорость роста ледяных кристаллов в клетке может быть понижена за счет добавления к воде примесей, повышающих ее вязкость, – того же глицерина, сахаров и др. Кроме того, существуют вещества, блокирующие образование кристалликов льда. Такими свойствами обладают, например. специальные белки, вырабатываемые организмами ряда холодоустойчивых животных – арктических и антарктических рыб, некоторых насекомых и др. Молекулы этих веществ имеют участки, обладающие комплементарностью к поверхности кристаллика льда, – «садясь» на эту поверхность, они приостанавливают его дальнейший рост.

При охлаждении крупных (по сравнению с клеткой – от 1 мм и больше) объектов внутри них возникают, как правило, значительные градиенты температуры. Сначала замерзают внешние слои, и формируется так называемый фронт кристаллизации, движущийся снаружи внутрь. Концентрация растворенных в воде солей и других веществ перед этим фронтом резко увеличивается. Это приводит к денатурации белков и повреждениям других макромолекул клетки. Другой проблемой оказывается растрескивание тканей. Его причина – неравномерное и неоднородное охлаждение, особенно в ситуации, когда наружные слои затвердевают раньше внутренних.

Еще в 60-е гг. ХХ в. была предложена идея использовать для управления кристаллизацией воды высокое давление. Идея эта основана на понижении температуры фазового перехода вода/лед при повышении давления. При 2045 атм. температура кристаллизации чистой воды составляет –22 °С. Бoльшего снижения температуры замерзания достичь таким образом не удается – при дальнейшем росте давления она начинает вновь повышаться.

Еще в 1967 г. американец М.Д. Персидски и его коллеги поставили эксперименты по замораживанию почек собаки. Исследователи подвергали почки перфузии 15%-ным раствором диметилсульфоксида (перфузия – введение веществ в биологический объект через систему кровеносных сосудов), после чего охлаждали их с одновременным повышением давления, так чтобы в каждый конкретный момент температура не была ниже точки замерзания, соответствующей данному давлению. Когда минимальное значение температуры (в данном случае, благодаря присутствию криопротектора оно составило около –25 °С) было достигнуто, давление снижали.

При быстром снятии давления переохлажденная до такой температуры жидкость может существовать не более нескольких секунд, после чего происходит спонтанная кристаллизация. Но кристаллы, образующиеся при этом, равномерно распределены по объему образца, и фронта кристаллизации не возникает, также как и неравномерного повышения концентрации солей. Кроме того, кристаллы, возникающие в этом случае, имеют малые размеры и зернистую форму и поэтому наносят клеткам сравнительно малые повреждения.

Однако в ходе процесса кристаллизации выделяется значительное количество тепла (скрытая теплота кристаллизации), в результате чего образец нагревается – в конечном счете до температуры кристаллизации, т.е. при снижении давления до атмосферного – примерно до 0 °С. После чего процесс замерзания, естественно, останавливается. В итоге при снятии давления кристаллизоваться успевало всего лишь около 28% воды, а остальная ее часть оставалась жидкой.

Для того, чтобы кристаллизовалась вся вода, нужно было бы перед снижением давления охладить образец до температуры примерно –80 °С – однако в этом случае лед начал бы образовываться гораздо раньше. М.Персидски решил проблему путем циклического приложения давления. Разогревшийся до 0 °С после первого снятия давления образец начинали охлаждать вновь – одновременно с повторным повышением давления. При очередном его «сбросе» успевала замерзнуть следующая порция жидкости, и т.д. В результате удалось достичь практически полной и «безвредной» кристаллизации воды, после чего температуру можно было уже безбоязненно понизить до
–130 °С (и ниже) при обычном атмосферном давлении и сохранять почку в таком состоянии неограниченно долго.

При оттаивании цикл повторяли в обратном порядке: почку разогревали до –28 °С, после чего повышали давление до 2000 атм. При этом происходило относительно равномерное по объему таяние ледяных кристаллов. Затем образец постепенно разогревали с одновременным снижением давления.

Сохраненные таким образом почки, по словам авторов эксперимента, «проявляли меньше признаков повреждения тканей, чем почки, замороженные любым другим способом» – хотя и не сохраняли жизнеспособность...

В дальнейшем техника замораживания при высоком давлении использовалась при подготовке биологических образцов для микроскопических исследований. Для того, чтобы сделать достаточно тонкий срез, образец нужно предварительно перевести в твердое состояние, однако при обычной заморозке структуры клеток при этом повреждаются настолько, что изучать оказывается практически нечего...

Давление в несколько тысяч атмосфер с успехом используется при замораживании продуктов в пищевой промышленности. При этом преследуются две цели. Во-первых, после долгого (а значит, при максимально низкой температуре) хранения вкус замороженного продукта должен как можно меньше отличаться от свежего. Для этого также важно, чтобы при заморозке не были разрушены клетки, что может быть в определенной степени достигнуто замораживанием при давлении около 2 тыс. атм. Другая цель – одновременная стерилизация продукта, которая достигается, напротив, разрушением клеток присутствующих в нем бактерий. Для этого необходимо уже гораздо более высокое давление – в 6 тыс. атм. и больше.

О новых же попытках использовать высокое давление для обратимого сохранения органов или целых организмов авторам неизвестно, а между тем этот путь кажется весьма перспективным. Разумеется, встает вопрос о повреждающем воздействии высокого давления. Известно, что при постепенном его повышении до примерно 500 атм. жизнеспособность клеток не снижается. При 6000 атм. и более практически все клетки погибают, а вот промежуточные значения могут оказывать различный эффект, в зависимости от типа и состояния клеток, содержания в них воды, солей и других веществ, температуры и т. д.

Однако можно рассчитывать, что постепенное повышение давления до необходимых 2 тыс. атм. не приведет к повреждению организма. Ведь в ходе подготовки к заморозке объект сначала охлаждается примерно до 0 °С (если это живое существо – оно перестает дышать) и помещается в заполненную жидкостью камеру. В 1961 г. американский исследователь С.Джейкоб в течение 30 минут подвергал давлению около 1000 атм. сердце собаки, только что вынутое из тела и продолжавшее сокращаться. После снятия давления сердцебиение возобновлялось.

Важно также, что некоторые вещества-криопротекторы оказываются одновременно и баропротекторами, т. е. защищают клетки и от воздействия высокого давления. «Хороший» криопротектор не только снижает температуру замерзания раствора, но и стабилизирует клеточные мембраны, делая их более эластичными.

Конечно, необходимо решить еще целый ряд проблем: в ходе экспериментов отработать оптимальный режим охлаждения, подобрать конкретные криопротекторы и т. д. Например, при прохождении циклов «сжатие с охлаждением – снятие давления» охлаждение происходит только с поверхности объекта. Это приводит к тому, что на периферии лед будет образовываться, тогда как в центре может, наоборот, происходить таяние уже имеющегося льда за счет повышения давления. Бороться с этим можно, как понижая температуру медленнее (и позволяя объекту охлаждаться более равномерно), так и повышая концентрацию веществ-криопротекторов в наружных слоях. При этом не обязательно повышать давление до максимальных значений. Можно, увеличив число циклов, оставаться в пределах заведомо безопасных 500–1000 атмосфер.

К тому же, как показали эксперименты Смит с золотистыми хомячками, для обратимого криосохранения может оказаться достаточно витрификации всего около 40% воды (и кристаллизации остальной части).

Так что имеющиеся данные вполне позволяют надеяться на использование высоких давлений для управления кристаллизацией свободной воды и криосохранения крупных биологических объектов-органов и даже целых организмов. Работы в этом направлении ведутся в Институте биофизики клетки РАН (Лаборатория криоконсервации генетических ресурсов под руководством Э.Н. Гаховой) совместно с Институтом биомедицинских технологий и ГосНИИ ВТ им. С.А. Векшинского.